A partir d’un antigène donné, MImAbs produit, sélectionne et optimise les anticorps pour mieux les adapter à l’application prévue.
À partir de différents antigènes (cellules, protéines recombinantes, peptides, ARNm, etc.), MImAbs produit rapidement et examine automatiquement plusieurs dixaines de milliers de cellules B uniques (jusqu'à 11 000 cellules par puces) avec la plateforme Optofluidic Beacon® (Bruker Cellular Analysis).
Immunisation
- De souris (BALB/c, C57Bl/6 et modèles KO)ou des souris humanisées ATX-Gx™ (fournisseur certifié des modèles ATX-Gx™d'Alloy-Therapeutics) avec des injections répétées.
- Contrôlée via une titration sérique par ELISA ou FACS.
Etapes sur le Beacon®
- Jusqu'à 40 000 plasmocytes (11 000 cellules B uniques par puce) provenant de rate ou de moelle osseuse, ensemencés dans des chambres NanoPen™ et criblés par campagnes Beacon®.
- Criblage fonctionnel rapide sur puce au niveau de la cellule unique avec un antigène recombinant ou un transfectant exprimant l'antigène.
- Un large choix de critères de sélection pour le criblage Beacon® : reconnaissance de l'antigène, activité de blocage, propriétés de réactivité croisée.
- Exportation des hits d'intérêt et séquençage.
- Présélection des hits par analyse et modélisation in sillico des séquences : points de fragilité des CDR, patchs des CDR, etc.
MImAbs a développé une collection de vecteurs adaptables pour la production de différents formats (Fc compétent ou Fc silencieux, ingénierie des cystéines, fragments d'anticorps, formats bispécifiques ou multispécifiques). Ils peuvent être utilisés pour cloner les anticorps produits par MImAbs durant les campagnes Beacon® ou les séquences fournies par les clients.
Les processus de clonage ont été complètement automatisés grâce aux robots Tecan EVO200 et FLUENT 780 afin d’assurer un processus haut débit, rapide et performant.
Choix du format de l’anticorps
MImAbs peut produire des anticorps humains et de souris en différents formats standards ou personnalisés (IgG, Fab, Fab’, Fab’2…). Différents formats peuvent être envisagés ; ceux qui sont prêts et disponibles immédiatement incluent :
Reference | Antibody format | Description | Purpose |
GD | Mouse IgG1 | Heavy chain mutation: D265A | Fc silent, deglycosylated antibody |
GE | Human IgG1 | Heavy chain mutation: E345K | mAb multimerization |
GH | Human hybrid CH1 (IgG2) CH2-CH3 (IgG1) | Heavy chain mutation: C219S | Enhanced mAb internalisation |
M1 | Human IgG1 | Heavy chain mutations: L235V, F243L, R292P, Y300L, P396L | Enhanced ADCC response |
S1 | Human IgG1 | Heavy chain mutation: N297S | Deglycosylated antibody 2 BTG coupling sites |
S2 | Human or mouse IgG1 | Heavy chain mutation: N297Q | Deglycosylated antibody 4 BTG coupling sites |
V1 | Human IgG1 | Heavy chain mutations: E233D, G237D, P238D, H268D, P271G, A330R | Enhanced binding to the Fc-g-RIIB receptor |
Production d'anticorps
MImAbs produit des anticorps de la micro-échelle (100 µg) jusqu'à plusieurs centaines de milligrammes, en fonction de leur utilisation.
- Production et purification à micro-échelle (100 µg) pour la détermination de l'EC50, en particulier pour les hits sélectionnés par Beacon® (jusqu'à 100 hits).
- Production et purification à l'échelle du milligramme pour les essais in vitro / fonctionnels.
- Production et purification à plus grande échelle (plusieurs centaines de mg jusqu'au gramme) pour des études pharmacologiques in vivo ou de toxicité.
L’humanisation est importante afin d’empêcher une réaction immunitaire contre les anticorps de rongeurs chez les patients. MImAbs opère par greffe du CDR en suivant trois étapes clés :
Détermination de la séquence humaine la plus proche
Les séquences de gènes d’immunoglobuline VH et VL humains sont analysées à l’aide de deux outils in silico: IMGT et IGBLAST. Les immunoglobulines qui sont phylogénétiquement les plus proches de l’anticorps du rongeur parent sont utilisées comme « framework » pour l’anticorps humanisé (FR).
Définition des CDR
Les trois régions déterminant la complémentarité des domaines variables (CDRs) sont définies en suivant les systèmes de nomenclature de Kabat et IMGT, et sont introduites dans la séquence FR humaine.
Backmutations
Des résidus supplémentaires provenant de l’anticorps murin sont réintroduits dans la séquence FR humaine afin de préserver la structure de l’anticorps et la spécificité de l’antigène :
Les résidus responsables de l’ancrage du CDR
Les résidus de la zone Vernier qui sont directement sous les CDRs et qui sont importants pour maintenir la confomration des CDRs3
Les résidus impliqués dans l’intéraction entre les chaînes lourdes et légères
Le résultat du processus d’humanisation consiste en 9 à 16 versions humanisées de l’anticorps contenant des backmoutations dans les chaînes VH et VL et pouvant être testées pour leur liaison et leur spécificité envers l’antigène.
1 Kabat EA et al, NIH Publication 1991
2 Lefranc MP et al, Dev Comp Immunol 2003
3 Foote et Winter, J Mol Biol 1992