mAb : génération et ingénierie

mAb : génération et ingénierie

Créer le bon format d’anticorps


A partir d’un antigène donné, MI-mAbs produit, sélectionne et optimise les anticorps pour mieux les adapter à l’application prévue.

À partir de différents antigènes (cellules, protéines recombinantes, peptides, etc.), MI-mAbs produit rapidement et examine automatiquement des milliers de clones d’hybridomes.

Immunisation

  • De souris (BALB/c et C57Bl/6 KO)ou de rats (Wistar) avec des injections répétées.

  • Contrôlée via une titration sérique par ELISA ou FACS.

 

Fusion et clonage des hybridomes 

  • Effectués entre splénocytes et une lignée cellulaire de myélome de souris (X63-Ag8-656) en milieu semi solide (méthylcellulose) pour le développement de colonies individuelles.

  • Les clones sont automatiquement examinés et sélectionnés afin d’assurer la clonalité et la bonne production d’anticorps, en utilisant le système de sélection de colonies de cellules de mammifères ClonePixTM 2 de Molecular Devices (taille, forme, distance aux clones voisins, sécrétion d’IgG)

 

Spécificité envers l’antigène

L’isolation automatique des clones est suivie de deux phases de sélection pour isoler ceux qui produisent les anticorps spécifiques aux antigènes, en utilisant :

  • Un test ELISA – pour les antigènes solubles

  • Du FACS haut débit – pour les antigènes s’exprimant à la surface de la cellule

En raison de la nature instable des hybridomes, MI-mAbs choisit de séquencer et cloner rapidement les anticorps en vecteurs d’expression mammifères. MI-mAbs a développé une collection de vecteurs adaptables pour la production de différents formats. Ils peuvent être utilisés pour cloner les anticorps produits par MI-mAbs ou les séquences fournies par les clients.

Les processus de séquençage et de clonage ont été complètement automatisés grâce au robot Tecan EVO200 afin d’assurer un processus rapide et performant.

 

Séquençage de l’anticorps

L’ARN messager des clones est soumis à une transcription inverse en ADNc et amplifié avant de séquencer les chaînes lourdes (VH) et légères (VL) de l’anticorps. Plusieurs réactions de séquençage sont effectuées afin de contrôler les erreurs de PCR et de séquençage.

 

Choix du format de l’anticorps

MI-mAbs peut produire des anticorps humains et de souris en différents formats standards ou personnalisés (IgG, Fab, Fab’, Fab’2…). Différents formats peuvent être envisagés ; ceux qui sont prêts et disponibles immédiatement incluent :

Reference

Antibody format

Description

Purpose

GD

Mouse IgG1

Heavy chain mutation:

D265A

Fc silent, deglycosylated antibody

GE

Human IgG1

Heavy chain mutation:

E345K

mAb multimerization

GH

Human hybrid

CH1 (IgG2)

CH2-CH3 (IgG1)

Heavy chain mutation:

C219S

Enhanced mAb internalisation

M1

Human IgG1

Heavy chain mutations:

L235V, F243L, R292P,

Y300L, P396L

Enhanced ADCC response

S1

Human IgG1

Heavy chain mutation:

N297S

Deglycosylated antibody

2 BTG coupling sites

S2

Human or mouse IgG1

Heavy chain mutation:

N297Q

Deglycosylated antibody

4 BTG coupling sites

V1

Human IgG1

Heavy chain mutations:

E233D, G237D, P238D,

H268D, P271G, A330R

Enhanced binding to the Fc-g-RIIB receptor

L’humanisation est importante afin d’empêcher une réaction immunitaire contre les anticorps de rongeurs chez les patients. MI-mAbs opère par greffe du CDR en suivant trois étapes clés :

 

Détermination de la séquence humaine la plus proche

Les séquences de gènes d’immunoglobuline VH et VL humains sont analysées à l’aide de deux outils in silico: IMGT et IGBLAST. Les immunoglobulines qui sont phylogénétiquement les plus proches de l’anticorps du rongeur parent sont utilisées comme « framework » pour l’anticorps humanisé (FR).

 

Définition des CDR

Les trois régions déterminant la complémentarité des domaines variables (CDRs) sont définies en suivant les systèmes de nomenclature de Kabat et IMGT, et sont introduites dans la séquence FR humaine.

 

Backmutations

Des résidus supplémentaires provenant de l’anticorps murin sont réintroduits dans la séquence FR humaine afin de préserver la structure de l’anticorps et la spécificité de l’antigène :

  • Les résidus responsables de l’ancrage du CDR

  • Les résidus de la zone Vernier qui sont directement sous les CDRs et qui sont importants pour maintenir la confomration des CDRs3

  • Les résidus impliqués dans l’intéraction entre les chaînes lourdes et légères

Le résultat du processus d’humanisation consiste en 9 à 16 versions humanisées de l’anticorps contenant des backmoutations dans les chaînes VH et VL et pouvant être testées pour leur liaison et leur spécificité envers l’antigène.

 

1 Kabat EA et al, NIH Publication 1991

2 Lefranc MP et al, Dev Comp Immunol 2003

3 Foote et Winter, J Mol Biol 1992

Les nanobodies sont de petits anticorps à chaînes lourdes qui dérivent d’un type d’anticorps présents dans les camélidés (chameaux, lamas…) et dont les sites de liaison à l’antigène consistent en un seul domaine, connu sous le nom de VHH. Les nanobodies gardent les propriétés de la liaison à l’antigène intactes, sont très stables et se lient de manière préférentielle à des antigènes enfouis, typiquement inaccessibles aux anticorps conventionnels. MI-mAbs fait appel à son partenariat avec la plateforme Nanobodies  du CRCM (Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille) afin de produire des nanobodies sur-mesure et de haute qualité, à partir soit d’immunisations de lama ou soit de banques de phage display de lamas produites en interne.

 

Pour plus d’informations, rendez-vous sur le site du  CRCM.