A partir d’un antigène donné, MImAbs produit, sélectionne et optimise les anticorps pour mieux les adapter à l’application prévue.
À partir de différents antigènes (cellules, protéines recombinantes, peptides, etc.), MImAbs produit rapidement et examine automatiquement des milliers de clones d’hybridomes.
Immunisation
De souris (BALB/c et C57Bl/6 KO)ou de rats (Wistar) avec des injections répétées.
Contrôlée via une titration sérique par ELISA ou FACS.
Fusion et clonage des hybridomes
Effectués entre splénocytes et une lignée cellulaire de myélome de souris (X63-Ag8-656) en milieu semi solide (méthylcellulose) pour le développement de colonies individuelles.
Les clones sont automatiquement examinés et sélectionnés afin d’assurer la clonalité et la bonne production d’anticorps, en utilisant le système de sélection de colonies de cellules de mammifères ClonePixTM 2 de Molecular Devices (taille, forme, distance aux clones voisins, sécrétion d’IgG)
Spécificité envers l’antigène
L’isolation automatique des clones est suivie de deux phases de sélection pour isoler ceux qui produisent les anticorps spécifiques aux antigènes, en utilisant :
Un test ELISA – pour les antigènes solubles
Du FACS haut débit – pour les antigènes s’exprimant à la surface de la cellule
En raison de la nature instable des hybridomes, MImAbs choisit de séquencer et cloner rapidement les anticorps en vecteurs d’expression mammifères. MImAbs a développé une collection de vecteurs adaptables pour la production de différents formats. Ils peuvent être utilisés pour cloner les anticorps produits par MImAbs ou les séquences fournies par les clients.
Les processus de séquençage et de clonage ont été complètement automatisés grâce au robot Tecan EVO200 afin d’assurer un processus rapide et performant.
Séquençage de l’anticorps
L’ARN messager des clones est soumis à une transcription inverse en ADNc et amplifié avant de séquencer les chaînes lourdes (VH) et légères (VL) de l’anticorps. Plusieurs réactions de séquençage sont effectuées afin de contrôler les erreurs de PCR et de séquençage.
Choix du format de l’anticorps
MImAbs peut produire des anticorps humains et de souris en différents formats standards ou personnalisés (IgG, Fab, Fab’, Fab’2…). Différents formats peuvent être envisagés ; ceux qui sont prêts et disponibles immédiatement incluent :
Reference | Antibody format | Description | Purpose |
GD | Mouse IgG1 | Heavy chain mutation: D265A | Fc silent, deglycosylated antibody |
GE | Human IgG1 | Heavy chain mutation: E345K | mAb multimerization |
GH | Human hybrid CH1 (IgG2) CH2-CH3 (IgG1) | Heavy chain mutation: C219S | Enhanced mAb internalisation |
M1 | Human IgG1 | Heavy chain mutations: L235V, F243L, R292P, Y300L, P396L | Enhanced ADCC response |
S1 | Human IgG1 | Heavy chain mutation: N297S | Deglycosylated antibody 2 BTG coupling sites |
S2 | Human or mouse IgG1 | Heavy chain mutation: N297Q | Deglycosylated antibody 4 BTG coupling sites |
V1 | Human IgG1 | Heavy chain mutations: E233D, G237D, P238D, H268D, P271G, A330R | Enhanced binding to the Fc-g-RIIB receptor |
L’humanisation est importante afin d’empêcher une réaction immunitaire contre les anticorps de rongeurs chez les patients. MImAbs opère par greffe du CDR en suivant trois étapes clés :
Détermination de la séquence humaine la plus proche
Les séquences de gènes d’immunoglobuline VH et VL humains sont analysées à l’aide de deux outils in silico: IMGT et IGBLAST. Les immunoglobulines qui sont phylogénétiquement les plus proches de l’anticorps du rongeur parent sont utilisées comme « framework » pour l’anticorps humanisé (FR).
Définition des CDR
Les trois régions déterminant la complémentarité des domaines variables (CDRs) sont définies en suivant les systèmes de nomenclature de Kabat et IMGT, et sont introduites dans la séquence FR humaine.
Backmutations
Des résidus supplémentaires provenant de l’anticorps murin sont réintroduits dans la séquence FR humaine afin de préserver la structure de l’anticorps et la spécificité de l’antigène :
Les résidus responsables de l’ancrage du CDR
Les résidus de la zone Vernier qui sont directement sous les CDRs et qui sont importants pour maintenir la confomration des CDRs3
Les résidus impliqués dans l’intéraction entre les chaînes lourdes et légères
Le résultat du processus d’humanisation consiste en 9 à 16 versions humanisées de l’anticorps contenant des backmoutations dans les chaînes VH et VL et pouvant être testées pour leur liaison et leur spécificité envers l’antigène.
1 Kabat EA et al, NIH Publication 1991
2 Lefranc MP et al, Dev Comp Immunol 2003
3 Foote et Winter, J Mol Biol 1992